細胞培養(yǎng)基礎知識-干細胞培養(yǎng)基和培養(yǎng)基添加劑

　　一、基礎培養(yǎng)基

　　經(jīng)典基礎培養(yǎng)基（DMEM、MEM、RPMI等）是化學成分明確的配方，每種配方都是為支持特定的細胞系或培養(yǎng)條件而開發(fā)的。

　　許多基礎培養(yǎng)基起初是使用小鼠成纖維細胞、HeLa或CHO細胞系開發(fā)的，并且隨著時間的推移進行修改已經(jīng)建立了適用于多種細胞類型的基礎培養(yǎng)基。DMEM/F12是一種使用較為廣泛的干細胞基礎培養(yǎng)基，它實質是由(Ham's F12培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基的1:1混合物.

　　常見的幾種基礎培養(yǎng)基：

　　RPMI培養(yǎng)基：由洛斯維·帕克紀念研究所研發(fā)

　　BME培養(yǎng)基：屬于Eagle的基礎培養(yǎng)基

　　MEM培養(yǎng)基：屬于改良的Eagle培養(yǎng)基

　　DMEM培養(yǎng)基：Dulbecco改良型培養(yǎng)基

　　二、緩沖液

　　干細胞培養(yǎng)基在滿足培養(yǎng)細胞的營養(yǎng)需求之外，還要注意細胞的培養(yǎng)條件。多數(shù)哺乳動物細胞生長的PH值為：在7.4的左右，所以，維持相對穩(wěn)定的PH環(huán)境也很重要。細胞培養(yǎng)時由于加入了二氧化碳，此時會產生HCO3-從而降低培養(yǎng)基中的pH值。

　　三、碳酸氫鈉

　　為了穩(wěn)定CO 2培養(yǎng)箱內pH值的變化，碳酸氫鈉(NaHCO 3)是一種無毒的天然緩沖液，通常包含在干細胞培養(yǎng)基中。作為一般經(jīng)驗法則，當在5%CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時，需要1.5 g/L的NaHCO 3以將培養(yǎng)基的pH值保持在7.4。

　　H 2 O+CO 2↔H 2 CO 3↔H++HCO 3¯

　　NaHCO 3↔Na++HCO 3¯

　　上面公式所表達的是：細胞培養(yǎng)基中的CO 2產生酸性條件。碳酸氫鈉緩沖該反應。

　　四、肝素

　　HEPES是一種兩性離子有機緩沖液，它的主要作用也是為了維持培養(yǎng)基的pH值。如果您所培養(yǎng)的細胞對PH環(huán)境較為敏感時，建議添加HEPES，這樣不僅可以增加緩沖能力還能夠將pH值穩(wěn)定在7.2至7.6范圍內。

　　五、酚紅

　　除了二氧化碳水平以外，細胞的代謝產物、培養(yǎng)基添加劑或其他因素同樣會影響到干細胞培養(yǎng)基的pH值。所以，在培養(yǎng)基和干細胞培養(yǎng)基中也常常會添加酚紅作為視覺pH指示劑，在pH值為7.4左右時，含有酚紅的培養(yǎng)基會呈現(xiàn)紅色，并且會隨著pH值的波動從亮黃色到深紫色不等。如果您的細胞對雌激素比較敏感，請選擇不含酚紅的培養(yǎng)基，因為這種化合物會模仿某些類固醇激素的作用。

　　六、酸堿度

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　　圖為不同PH值下培養(yǎng)基中酚紅的視覺展示效果。

　　七、谷氨酰胺

　　細胞所需要的營養(yǎng)物質還包括：必需氨基酸和維生素。其中L-谷氨酰胺是多數(shù)細胞培養(yǎng)基所需要的一種添加劑，它的主要作用是促進氮的儲存與向培養(yǎng)細胞的轉移。還有谷氨酰胺也常常會添加在干細胞培養(yǎng)基中，主要作用是在高能量需求時作為能量來源使用。所以，一般適用于增殖迅速的細胞類型或在低氧、低代謝條件下培養(yǎng)的細胞。

　　然而，在培養(yǎng)基介質中時，游離L-谷氨酰胺比較不穩(wěn)定。比如：在環(huán)境溫度大于4°C時，細胞培養(yǎng)基中的L-谷氨酰胺會經(jīng)過非酶促反應降解為NH3-和焦谷氨酸。所以，一般情況下，L-谷氨酰胺必須在-20°C的低溫條件下冷凍保存。

　　八、L-丙氨酰/L-谷氨酰胺

　　L-丙氨酰和L-谷氨酰胺也是常添加在干細胞培養(yǎng)基中的物質，起主要作用是：谷氨酰胺的穩(wěn)定性降低谷氨酰胺的分解速度。例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺是一種二肽，即使在37°C下也能在細胞培養(yǎng)基中長期穩(wěn)定。用L-丙氨酰-L-谷氨酰胺補充干細胞培養(yǎng)基可以延長培養(yǎng)基在4°C下的保質期，并大大減少與谷氨酰胺分解成氨廢物相關的問題。

　　九、生長因子和培養(yǎng)基添加劑

　　1.生長因子

　　生長因子、細胞因子和趨化因子是細胞的化學信使。每種干細胞類型都需要補充特定生長因子的培養(yǎng)基，以維持或指導培養(yǎng)物的健康、增殖和分化。例如，在人胚胎干細胞ES和誘導多能干細胞iPS細胞培養(yǎng)基中通常會添加bFGF生長因子。干細胞培養(yǎng)基中使用的生長因子的質量會對培養(yǎng)產生深遠影響。比如：使用高生物活性、高純度的蛋白質折疊及生長因子可以獲得較好的蛋白重組效果。雖然生長因子和細胞因子在處于凍干狀態(tài)時性能穩(wěn)定，但當他們添加到培養(yǎng)基中時它的保質期就會變得很短。為避免成分降解，一般會在使用前將它們添加到培養(yǎng)基中。

　　2.氨基酸

　　細胞培養(yǎng)基中還經(jīng)常添加非必需氨基酸(NEAA)來刺激細胞的增殖并延長細胞的活力。雖然細胞也可以自然合成NEAA，但在培養(yǎng)基中補充非必需氨基酸可以減少低水平氨基酸水平所帶來的的副作用。

　　3.抗生素

　　實驗室經(jīng)常使用補充抗生素來控制在營養(yǎng)豐富的細胞培養(yǎng)環(huán)境中可能出現(xiàn)的細菌污染物的生長。除了原代細胞分離以外，不建議在干細胞培養(yǎng)中使用抗生素，因為常規(guī)的抗生素雖然可以防止污染發(fā)生，但是容易導致耐藥菌株的出現(xiàn)，甚至會干擾到細胞的正常代謝。

　　十、血清以及血清替代品

　　1.血清

　　多數(shù)哺乳動物細胞培養(yǎng)需要在培養(yǎng)基中添加血清。用于細胞培養(yǎng)的血清包含蛋白質、肽、生長因子、氨基酸、脂質、碳水化合物、激素、維生素等多種細胞所需的營養(yǎng)成分。干細胞培養(yǎng)基的胎牛血清(FBS)添加含量通常含在10%至20%之間。

　　2.無血清培養(yǎng)基

　　無血清(SF)培養(yǎng)基允許研究人員在無血清的情況下培養(yǎng)干細胞。無血清干細胞培養(yǎng)基的主要優(yōu)點是從更純的培養(yǎng)基配方中獲得一致且可重復的實驗結果。一般來說，無血清培養(yǎng)基被認為是成分確定的培養(yǎng)基，含有白蛋白、胰島素、硒和轉鐵蛋白來代替FBS。然而，成分確定的無血清培養(yǎng)基可包括血清來源的蛋白質，例如人血清白蛋白(HSA)。

　　重要的是要知道，干細胞在無血清環(huán)境中培養(yǎng)時會更加敏感。這在形態(tài)學、細胞密度、增殖率以及對機械和化學應力（包括解離酶和抗生素）的敏感性方面尤其明顯。例如，如果在無血清培養(yǎng)基中使用抗生素，通常最好使用終濃度為通常用于含血清培養(yǎng)基的1/5至1/10。

　　對于實驗要求不高的用戶或者想節(jié)約成本可以使用干粉培養(yǎng)基自行配制，但多數(shù)情況下都會選擇配置好的培養(yǎng)基或干細胞培養(yǎng)基，這樣開瓶后就能直接使用了。不僅可以節(jié)約時間，還省去了配制時的繁瑣環(huán)節(jié)。